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無溶劑體系脂肪酶催化合成1,3-丙二醇單酯

發布日期:2018-12-21 作者: 點擊:

無溶劑體系脂肪酶催化合成1,3-丙二醇單酯


張 凱1,李 偉1,陳華勇1,王永華2,楊 博1

(1.華南理工大學 生物科學與工程學院,廣州 510006; 2.華南理工大學 輕工與食品學院,廣州 510006)


摘要:在無溶劑體系中,用脂肪酶Novozyme 435催化1,3-丙二醇和油酸合成1,3-丙二醇單酯,同時確立酯化產物及油酸含量的HPLC-RID檢測方法。以1,3-丙二醇單酯最大生成量為目的,初步確定反應最優條件為:1,3-丙二醇和油酸摩爾比6∶ 1,反應溫度60 ℃,搖床轉速180 r/min,加酶量1%(以1,3-丙二醇和油酸的總質量為基準),反應時間8 h。該條件下產物中的1,3-丙二醇單酯含量達到48.21%。

關鍵詞:無溶劑體系;脂肪酶;1,3-丙二醇;1,3-丙二醇單酯

中圖分類號:TQ641;TS218   文獻標志碼:A   文章編號:1003-7969(2010)08-0028-04


Lipase-catalyzed synthesis of 1,3-propanediol monoester 

in a solvent-free system

ZHANG Kai1, LI Wei1, CHEN Huayong1,WANG Yonghua2 ,YANG Bo1

(1. School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,

China; 2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of 

Technology, Guangzhou 510006, China)


Abstract:In a solvent-free system,1,3-propanediol monoester was synthesized from 1,3-propanediol and oleic acid by using immobilized lipase Novozyme 435 as the biocatalyst, and HPLC-RID was developed for determination of the oleic acid content and the reaction products.The content of 1,3-propanediol monoester was used as an index,and the processing parameters were optimized as follows: molar ratio of 1,3-propanediol to oleic acid 6∶ 1, reaction temperature 60 ℃ , shaker rotating speed 180 r/min ,immobilized lipase amount 1%(based on the mass of 1,3-propanediol and oleic acid),reaction time 8 h.Under the optimum conditions, the content of 1,3-propanediol monoester was 48.21%.

Key words:solvent-free system;lipase;1,3-propanediol;1,3-propanediol monoester

    1,3-丙二醇與脂肪酸酯化可生產丙二醇酯,其中1,3-丙二醇單酯是一種良好的油包水型乳化劑,在油墨、涂料、日用化學品等領域有著廣泛應用。此外,1,3-丙二醇單酯的3-OH可以與其他C12~C30脂肪酸、營養物、藥物基團、生物活性基團等相連[1],形成的化合物在營養保健和生物醫藥方面有更廣闊的應用前景。

    工業上丙二醇酯是在有機溶劑中高溫下通過化學催化劑合成的,該工藝產品分離難度大,能耗高;而脂肪酶Novozyme 435生物酶法催化合成丙二醇酯,具有反應條件溫和、能耗低、環境友好等優點[2],在產業化方面具有良好的前景。

    生物催化體系中,選擇合適的溶劑可提高底物間的傳質效率[3]。據文獻報道[4,5],在丙二醇酯的酶法合成中,親脂性的有機溶劑不利于底物1,3-丙二醇的溶解;而親水性的有機溶劑則會導致反應速率降低。無溶劑體系合成丙二醇酯為反應提供了與傳統溶劑不同的新環境,酶直接作用于底物,可提高底物和產物濃度以及反應選擇性,同時克服了有機溶劑毒性大,對環境造成污染,回收和循環使用成本高等缺點[6]。

    本研究以1,3-丙二醇和油酸為底物,在無溶劑體系中采用脂肪酶Novozyme 435催化合成1,3-丙二醇單酯,探討不同因素對其合成的影響,初步優化合成工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑

    高效液相色譜儀,Waters 2414型示差折光檢測器,Waters 1525型HPLC 泵,Phenomenex Luna 5u silico (2) 100 (250 mm × 4.6 mm)色譜柱,CHZ-82A水浴恒溫搖床。固定化脂肪酶Novozyme 435(丹麥諾維信公司),1,3-丙二醇,油酸(分析純),1,3-丙二醇單酯和1,3-丙二醇二酯(Sigma公司),正己烷和異丙醇(色譜純)。

1.2 酯化方法

    取一定量的油酸和1,3-丙二醇于250 mL錐形瓶中,加入一定量脂肪酶Novozyme 435(以1,3-丙二醇和油酸體系總質量為基準),然后于不同轉速的水浴搖床中反應,定時取樣、待測。

1.3 分析方法

1.3.1 HPLC分析條件 流動相V(正己烷)∶ V(異丙醇)=90∶ 10,流速1.0 mL/min,柱箱溫度30 ℃,檢測器溫度35 ℃,進樣量10 μL。

1.3.2 標樣檢測 準確稱取質量為m0的1,3-丙二醇單酯標準品,溶解于一定體積的流動相中,在1.3.1 HPLC條件下檢測,確定其保留時間,同時記錄峰面積(A)。油酸和1,3-丙二醇二酯標準品按同樣方法檢測,確定其保留時間。

1.3.3 樣品檢測 準確稱取質量為m1的脂肪酶催化反應產物,溶解于一定體積的(與標樣體積相同)流動相中,在1.3.1 HPLC條件下檢測,根據標樣保留時間定性,記錄產物中1,3-丙二醇單酯峰面積(A1)。

    酯化反應產物中1,3-丙二醇單酯含量按下式計算:

    ω(1,3-丙二醇單酯)=A1m0/Am1×100%

2 結果與討論

2.1 酯化產物色譜分析

  酯化產物HPLC-RID檢測結果見圖1。

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圖1 酯化產物HPLC-RID色譜圖

    由圖1可見,1,3-丙二醇二酯、油酸、1,3-丙二醇單酯保留時間分別為3.240、3.715、6.228 min,游離脂肪酸和酯分離效果較好,7 min可以完成1個樣品的檢測。說明本文HPLC分析條件可滿足實驗要求。

2.2 反應條件對1,3-丙二醇單酯合成的影響

2.2.1 反應時間的影響 脂肪酶Novozyme 435催化反應時間過長會影響酶的活力,導致重復利用率低,故實驗考察了24 h內酶對1,3-丙二醇單酯合成的影響。在1,3-丙二醇和油酸摩爾比為3∶ 1,搖床轉速120 r/min,反應溫度50 ℃,加酶量1%條件下,反應時間對1,3-丙二醇單酯含量的影響見圖2。

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圖2 反應時間對1,3-丙二醇單酯含量的影響

    由圖2可見,在0.5~4 h內1,3-丙二醇單酯含量幾乎呈線性增長,在4~8 h反應速度有所下降,之后隨反應時間的延長,1,3-丙二醇單酯含量增長趨于平緩,體系基本達到平衡。在反應初始階段0.5~4 h,生成的1,3-丙二醇單酯有助于微乳體系的形成。在微乳體系中,底物油酸和1,3-丙二醇分散更均勻,反應速度更快。隨著反應時間的延長,由于底物濃度和酶活力的降低,反應速度逐漸減小。綜合考慮反應時間以8 h為宜。

2.2.2 底物摩爾比的影響 在搖床轉速120 r/min,反應溫度50 ℃,加酶量1%,反應時間6 h的條件下,底物摩爾比對1,3-丙二醇單酯含量的影響見圖 3。

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圖3 底物摩爾比對1,3-丙二醇單酯含量的影響

    由圖3可見,隨底物摩爾比的增加,1,3-丙二醇單酯含量也隨之增加,在6∶ 1時,達到最大值4620%,再繼續增加底物摩爾比,1,3-丙二醇單酯含量在1%左右波動,反應基本達到平衡。由于酶促反應時,首先是脂肪酶與油酸羧基形成酰基酶中間體,同時生成水,然后酰基受體1,3-丙二醇經羥基攻擊此親核中間體,發生酰基轉移生成丙二醇酯,脂肪酶同時被釋放。當1,3-丙二醇濃度較低時,搖床振蕩能使其均勻分散在反應體系中,其濃度增加可促進酯化反應的進行,但是當其濃度滿足親核的酰基酶中間體對受體需求后,即使濃度再增加酯化速度也不會明顯提高。綜合考慮,較佳的底物摩爾比為6∶ 1。

2.2.3 搖床轉速的影響 搖床轉速的大小關系到反應體系的傳質,選擇合適的搖床轉速既可以達到所需傳質效果,又可以節約能耗,故在1,3-丙二醇和油酸摩爾比為3∶ 1,反應溫度50 ℃,加酶量1%,反應時間6 h條件下,考察不同轉速對1,3-丙二醇單酯含量的影響,結果見圖4。

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圖4 搖床轉速對1,3-丙二醇單酯含量的影響

    由圖4可見,隨搖床轉速的提高,1,3-丙二醇單酯含量也相應提高,最后變化趨于平緩。可能是轉速的提高有效地克服了底物黏度帶來的傳質阻力,提高了傳質效果,使酶周圍底物濃度增加,但是當轉速繼續提高,傳質速度不再是影響反應的主要因素,酶和底物自身反應速度成了整個反應的限制因素,因而繼續提高轉速,1,3-丙二醇單酯含量也無明顯提高。綜合考慮最佳轉速為180 r/min。

2.2.4 反應溫度的影響 溫度變化直接影響脂肪酶活力以及酶和底物親和力,進而影響1,3-丙二醇單酯的合成。在1,3-丙二醇和油酸摩爾比為3∶ 1,搖床轉速120 r/min,加酶量1%,反應時間6 h條件下,反應溫度對1,3-丙二醇單酯含量的影響見圖5。

    由圖5可見,在30~60 ℃范圍內,1,3-丙二醇單酯含量隨溫度升高逐漸增加,說明脂肪酶活力隨溫度升高逐漸增加,同時溫度提高也降低了無溶劑體系黏度,間接提高了傳質效果。60 ℃下1,3-丙二醇單酯含量達到46.06%。當溫度繼續升高到70 ℃時,1,3-丙二醇單酯含量有所降低,可能是溫度過高酶空間結構發生改變,導致酶活力受到影響,催化效率降低。綜合考慮反應溫度以60 ℃為佳。

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圖5 反應溫度對1,3-丙二醇單酯含量的影響

2.2.5 加酶量的影響 在1,3-丙二醇和油酸摩爾比為3∶ 1,搖床轉速120 r/min,反應溫度50 ℃,反應時間8 h條件下,加酶量對1,3-丙二醇單酯含量的影響見圖6。

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圖6 加酶量對1,3-丙二醇單酯含量的影響

    脂肪酶作為高效催化劑,其添加量對酯化反應起關鍵作用。由圖6可以看出,加酶量在0.25%~1.0%之間時,隨加酶量的增加,1,3-丙二醇單酯含量得到提高,可能是加酶量增加提高了底物周圍酶濃度,加速了底物油酸和1,3-丙二醇的酯化速度;加酶量超過1%之后,隨著加酶量的增大,1,3-丙二醇單酯含量變化不大,可能是酶活性基團和底物嵌合達到飽和,或者是酶不能完全懸浮,造成乳化界面減少,傳質受限所致。脂肪酶Novozyme 435成本較高,從經濟和催化效果綜合考慮,最佳的加酶量為1%。

3 結 論

    通過脂肪酶Novozyme 435催化油酸和1,3-丙二醇反應合成1,3-丙二醇單酯條件的研究,確定1,3-丙二醇單酯最大生成量的優化條件為:1,3-丙二醇和油酸摩爾比6∶ 1,反應時間8 h,搖床轉速180 r/min,反應溫度60 ℃,加酶量1%。在此條件下,產物中1,3-丙二醇單酯含量達到48.21%。同時確立了油酸和酯化產物HPLC-RID檢測方法,7 min可完成1個樣品的分析。


參考文獻:

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